用于成年糖尿病患者锌转运蛋白8自身抗体检测的桥联ELISA法发表时间：2023-12-11 11:56 锌转运蛋白 8的自身抗体（ZnT8A）目前已被确定为 T1DM 的特异性标志物[12]，有助于诊断时的糖尿病分型[1,3]。ZnT8A检测可增加多项抗体阳性患者的抗体检出率[1,3]。 ZnT8A主要靶向ZnT8氨基酸序列268-369的C端结构域。基因的多态性使第325氨基酸的密码子可表达出三种蛋白质：精氨酸（R）325，色氨酸（W）325以及少见的谷氨酰胺（Q）325。据报道，在 421 名新确诊的 T1DM 患者中，有 259 人的血清至少与 ZnT8 C端变体（R325、W325或Q325）中的一个发生反应[6]。此外，研究表明，一些血清仅对R325或W325发生反应，但仅对Q325发生反应的血清非常罕见[6,8–10]。 英国斯旺西大学生命科学学院2015年发表的一个研究，研究的目的是评估桥联ELISA 检测 ZnT8A 的性能。该测定基于 ZnT8抗体二价结合的能力，抗体的其中一臂与包被在板孔上的ZnT8结合，另一臂与液相ZnT8-生物素结合，从而形成桥式结构。 结论：ZnT8A桥联ELISA是一种高重复性且简便的检测方法。加测 ZnT8A可提高成人T1DM 自身抗体阳性检出率。 材料与方法 1. 血清样本 疾病组：94 名 T1DM 患者血清样本，确诊后采血时间间隔中位数 29.5 天（范围：1-243 天）；51 名诊断时采集且未经治疗的 LADA患者血清样本；59 名T2DM患者血清。 T2DM患者治疗史：28 名尚未进行糖尿病治疗；剩余31 名患者样本是在诊断后平均 5 年（范围 1-20 年）内获取的：12 名仅控制饮食治疗，6名仅接受二甲双胍治疗，2 名仅接受格列齐特治疗，7名接受二甲双胍和格列齐特联合治疗，4名接受胰岛素治疗。 表1 受试者详情  疾病对照组：30例格雷夫斯病（GD）患者血清样本、20例Addison病（AD）患者血清样本。 健康对照组：200例成年健康血清样本（HBD）。 2. 自身抗体检测 使用商品化试剂盒（桥联ELISA法，RSR Ltd）对 T1DM、LADA、T2DM 患者和 HBD 患者的血清样本进行 ZnT8A 检测。 根据试剂盒说明，大于等于15 u/mL的结果被归类为 ZnT8A 阳性。多年参与胰岛自身抗体标准化计划工作组（IASP）的评估，2012年评估结果显示ZnT8A ELISA的敏感性和特异性分别为72%和99%，2013年评估结果显示ZnT8A ELISA的敏感性和特异性分别为74%和99%。 采用放射免疫沉淀法（IPA）或ELISA（RSR Ltd，Cardiff，UK）[20,21]检测GADA和IA-2A。 IAA采用IPA试剂盒（RSR Ltd）[22]进行检测。 结果 1. ZnT8A 酶联免疫吸附试验的检测性能 在测量中，使用ZnT8A试剂盒自带质控品（样本A和样本B）以确定检测的批内变异系数（n = 10）和批间变异系数（n = 6）。表 2 列出了批间和批内的 CV 值，对于中等浓度水平的的ZnT8A质控品A，批间CV 值为7.1% 和批内CV值为1.7%，而对于高浓度水平的ZnT8A质控品B，批间CV 值为 8.5% 和 批内CV值为2.7%。 表 2 批间和批内的 CV 值  ZnT8A 阳性的血清样本平均 CV%为 4.2%，ZnT8A 阴性的样本平均 CV%为 18.3%（下图所示）。  在200份HBD样品中仅有两份样品检出ZnT8A 阳性（1%），浓度分别为 40.5 和 44.7 u/mL。 ROC分析显示，在临界浓度为 15 u/mL 且曲线下面积为 0.80 时，ZnT8A ELISA的灵敏度为 54%，特异性为 99%（95% CI，0.74–0.86）。 2. 在不同患者群中ZnT8A的检出情况 51/94（54.3%）T1DM 患者的血清在 ZnT8A ELISA 检测中呈阳性（范围为 15.3-1483 u/mL），16/51（31.4%）LADA患者的血清在 ZnT8A ELISA 检测中呈阳性（范围为 25-2000 u/mL），1/59（1.7%）T2DM患者的血清在 ZnT8A ELISA 检测中呈阳性（浓度为 1200 u/mL）。 30 名格雷夫斯病患者的样本在 ELISA 中均呈 ZnT8A阴性；2/20 (10%) 例Addison病患者的样本呈 ZnT8A 阳性，浓度为23.6 和 48.2 u/mL。其中ZnT8A 浓度为 23.6 u/mL的Addison病患者中IAA和GADA也呈阳性，IA-2A 呈阴性。另一个ZnT8A 阳性的Addison病患者样本由于血清量不足，未进一步接受自身抗体检测。 3. ELISA和IPA两种方法学对比 对于ZnT8A的检测上，桥式ELISA法的灵敏度和特异性均更优于IPA法。  ELISA 和 IPA（W325/R325 二聚体抗原）在ZnT8A 检测抗体浓度结果上显示了高度一致性。在所有样本中相关系数r = 0.856（n = 204），在 T1DM 和 LADA 患者样本中相关系数r = 0.837（n = 145）。 4. 糖尿病患者的糖尿病自身抗体检出情况 在T1DM 患者中，51/94 (54.3%)呈ZnT8A ELISA阳性， 70/94 (74.5%)呈GADA阳性，42/94 (44.7%)呈IA-2A阳性，24/94 (25.5%)呈IAA阳性。80/94 (85.1%) 的T1DM患者为糖尿病自身抗体阳性（四种抗体至少一种为阳性），其中ZnT8A单项阳性的患者的占4/94 (4.3%)。 在LADA患者中，16/51 (31.4%)呈ZnT8A ELISA阳性，51/51 (100%)呈GADA阳性，12/51 (23.5%)呈IA-2A阳性，6/51 (11.8%)呈IAA阳性。 在80例糖尿病自身抗体阳性T1DM患者中，最佳的抗体3联检测组合是ZnT8A、GADA 和 IA-2A，可最大数量的检测出抗体阳性的患者，识别率为85.0% (68/80)。  讨论 本研究中评估了新型 ZnT8A ELISA 的性能，无论是低浓度还是高浓度的ZnT8A均表现出较高的重复性，ZnT8A 阳性样本的平均 CV% 小于 5%。ZnT8A ELISA 对 T1DM 的灵敏度为 54.1%，对HBD的特异性为 99%，其中ZnT8A单阳的占4/94 (4.3%)。 ELISA和IPA在测量ZnT8A之间存在良好的一致性，这与之前的报告一致[16]。对于T1DM，两种检测之间的一致性为91.5%。 在本研究中，加测ZnT8A可将基于 GADA、 IA-2A 和 IAA检测的自身抗体阳性的T1DM患者检出率从 80.9%（76/94）提高至85.1%（80/94），这与 Wenzlau 等人[1]的观察结果相似，ZnT8A检测可将基于 GADA、 IA-2A 和 IAA检测的自身抗体阳性患者的比例从 94%（210/223）增加到98% 。Vermeulen 等人 [3] 发现，ZnT8A检测可将基于 GADA、 IA-2A 和 IAA检测的自身抗体阳性患者的比例从 88%（578/655）增加到90%（589/655） 。 在本研究中，31.4%的 LADA 患者呈GADA、ZnT8A双阳。这与 Lampasona 等人[27] 和 Andersen 等人[28] 以前的报告一致。 研究表明，多抗体阳性与高危个体发展为糖尿病的风险增加有关[18，23，30，32，33]。Vermeulen等人[3]发现，在 >10 岁的患者分组中，用 ZnT8A 替代 IAA 可提高诊断灵敏度。 在本研究中，与 GADA、IA-2A 和 IAA 组合相比，ZnT8A、GADA 和 IA-2A 组合增加了自身免疫性糖尿病患者的检出率。这些差异可能是由于随着诊断年龄的增加，尤其是在 10 岁之后，IAA 检出率下降 [34]，而 ZnT8A 的检出率下降往往发生在 20 岁之后 [3]。在本研究中，T1DM 患者的平均年龄为 28 岁。此外，由于 IAA 水平可能会受到外源胰岛素引发免疫应答产生抗体的影响，因此 ZnT8A 在这些受试者中可能更具客观性。 综上所述，桥联ELISA是一种简便、重复性好的测定血清中ZnT8A的方法。ZnT8A ELISA 显示出较高的灵敏度和特异性，并且与参考 IPA 具有良好的一致性。将 ZnT8A 添加到现有的胰腺 β 细胞抗原自身抗体组筛查中，可改善了对单一和多重抗体阳性成年患者的检测。 想了解更多关于自身免疫性疾病及抗体检测的知识，请点击上方小程序，关注本公众账号。 [1]Luzio,Stephen,Coles,et al.Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus[J].Clinica chimica acta: International journal of clinical chemistry and applied molecular biology, 2015. |
